大豆是世界植物油的主要原料。大豆籽粒中含有20%左右的油脂，其主要成分是脂肪酸，約占總脂肪含量的90%，除脂肪酸外還包含約7%的磷脂和3%的糖脂。大豆脂肪酸主要包含5種組分，即飽和脂肪酸棕櫚酸和硬脂酸，不飽和脂肪酸油酸、亞油酸和亞麻酸，分別約占脂肪酸總量的11.36%、3.30%、54.87%、21.36%和8.96%，達到了總脂肪酸含量的99.85%。除上述五種脂肪酸組分以外，還有少量的豆蔻酸)、花生酸以及微量的棕櫚油酸、月桂酸和二十二碳酸等脂肪酸成分。大豆油脂中的不飽和脂肪酸有降低患心血管疾病風(fēng)險的作用，可降低人體中的有害膽固醇，但多不飽和脂肪酸，尤其是亞麻酸，容易被脂肪氧化酶氧化，從而產(chǎn)生豆腥味。改良大豆脂肪酸組分，提高其抗氧化性是近年來大豆脂肪酸育種的主要目標(biāo)。因此，大豆脂肪酸組分的定性定量檢測技術(shù)成為大豆脂肪酸組分改良研究工作中不可缺少評價手段。
大豆脂肪酸組分的檢測方法主要包括近紅外反射光譜分析法(NIRS)、高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜法(GC)，而應(yīng)用最為廣泛的當(dāng)屬氣相色譜法。目前，針對大豆脂肪酸的檢測主要以相對百分比含量測定為主，無法準確反映籽粒中脂肪酸組分的絕對含量，因此亟需建立大豆脂肪酸組分的絕對定量方法。本研究利用5種大豆脂肪酸甲酯為標(biāo)準樣品，采用加熱甲酯化提取法和氣相色譜分析方法(GC)相結(jié)合，建立了定性定量鑒定不同大豆脂肪酸組分的絕對含量的氣相色譜方法，并優(yōu)化了提取和GC檢測條件，實現(xiàn)了大豆脂肪酸組分含量檢測的定量化和計算方法的標(biāo)準化，為加速大豆脂肪酸育種和基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支撐。
1、脂肪酸組分的氣相色譜檢測條件
大豆脂肪酸含量采用泰特GC2030氣相色譜儀進行定性定量檢測。分析檢測條件為，色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm)；自動進樣，進樣量：lμL；采用分流進樣，分流比：40∶1；進樣口溫度：250℃；載氣：氮氣，54mL·min-1；氫氣，40mL·min-1；空氣，400mL·min-1；采取程序升溫的方式：180℃保持1.5min，以10℃·min-1升到210℃，保持2min，然后以5℃·min-1升到220℃保持5min；檢測器：火焰離子檢測器(FID)，溫度為300℃；每個樣品檢測20min，樣品檢測之間間隔2min。
2、脂肪酸標(biāo)準曲線的制作
準確稱取棕櫚酸甲酯標(biāo)準樣品 20.0mg 放入色譜專用樣品瓶中，加1.0mL正己烷至標(biāo)準樣品完全溶解。然后從樣品瓶中取500μL溶液放入另一樣品瓶中，加入等體積正己烷，混合均勻，以此類推進行半倍稀釋，制作不同梯度的標(biāo)準溶液，共設(shè)7個梯度。對稀釋好的標(biāo)準溶液進行氣相色譜分析，以標(biāo)準溶液濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制不同濃度梯度的標(biāo)準曲線。其余4種脂肪酸甲酯標(biāo)準樣品的處理方法與棕櫚酸甲酯相同。
3、豆粉脂肪酸提取
簡易甲酯化提取法(方法一)：準確稱取大豆粉30.0mg，放入2.0mL的離心管中，加入1.0mL正己烷浸提20min；然后加入1.0mL 0.5mol/L甲醇鈉溶液進行甲酯化，充分搖勻10min，使其充分甲酯化，靜置，取上清液放置于色譜專用樣品瓶中，4℃冰箱保存待檢測。
加熱甲酯化提取法(方法二)：準確稱取大豆粉30.0mg，放入2.0mL的離心管中，加入1.0mL正己烷，60℃加熱浸提20min，間隔充分搖勻；然后加入1.0mL 0.5mol/L甲醇鈉溶液進行甲酯化，充分搖勻10min，使其充分甲酯化；靜置，取上清液放置于色譜專用樣品瓶中，4℃冰箱保存待檢測。
4、不同檢測方法的比較
國內(nèi)外針對脂肪酸含量的檢測主要集中于脂肪酸主要組分相對含量的測定，而大豆中脂肪酸絕對含量測定的研究相對較少，僅局限于近紅外光譜法。近紅外光譜法雖然方便快捷，無需對樣品破壞性處理，但它是一種間接的分析技術(shù)，需利用化學(xué)計量學(xué)方法建立預(yù)測模型，然后通過預(yù)測模型預(yù)測樣品的組分含量。
本文采用五種脂肪酸甲酯作為標(biāo)準樣品可以準確地定性不同脂肪酸組分，結(jié)合氣相色譜進行脂肪酸檢測，并制作脂肪酸甲酯標(biāo)準曲線，其決定系數(shù)(R2)均大于0.99。在定性的基礎(chǔ)上僅通過公式計算可得大豆樣品各脂肪酸組分絕對含量，提高了脂肪酸試驗數(shù)據(jù)的準確性。該計算方法可以利用較少的脂肪酸樣品，定性和定量檢測不同脂肪酸組分，實現(xiàn)了脂肪酸含量檢測計算方法的標(biāo)準化，為大豆脂肪酸的深入研究提供了技術(shù)支撐。
為建立大豆脂肪酸組分的絕對定量方法，采用加熱甲酯化提取法和氣相色譜分析法(GC)，以5種脂肪酸甲酯(棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯)為標(biāo)準樣品，在制定5種脂肪酸甲酯組分的標(biāo)準曲線(R2>0.99)和回歸方程的基礎(chǔ)上，建立了大豆脂肪酸組分的定量測定方法。該方法可以準確檢測大豆籽粒中脂肪酸組分的絕對含量。通過對4個油份含量不同的大豆品種脂肪酸含量測定以及與粗脂肪含量的比較分析發(fā)現(xiàn)，該方法可顯著提高籽粒中的脂肪酸提取率和檢測效率，其檢測的總脂肪酸含量占總油脂含量的94%以上。該方法不僅能檢測樣品中5種脂肪酸組分的相對百分比含量，還可以準確計算出籽粒中各個脂肪酸組分的絕對含量，對大豆脂肪酸檢測及育種具有重要意義。
